「読者一括登録」で「上書きする」にチェックしてアップロードすれば、CSVに記載のない過去の読者は自動的に削除されますか？（リストの総入れ替えはできますか？）

いいえ、『さぶみっと！メール配信』の読者一括登録機能において、「上書きする」にチェックを入れてアップロードしても、CSVファイルに記載されていない過去の読者が自動的に削除されることはありません。

「上書きする」は、すでに登録されている読者のうち「同じメールアドレスの登録情報」を新しい内容に更新（変更）する機能です。CSVに含まれていない既存のメールアドレスはそのまま残ります。

なお、最新のCSVデータのみを残したい（リストの総入れ替えをしたい）場合でも、管理画面から「読者一括削除」と「読者一括登録」を繰り返してリストを入れ替える運用は、利用規約にて禁止されております。

リストの総入れ替え（一括削除・登録の繰り返し）が禁止されている理由

読者を一度完全に削除して再登録すると、過去の「クリックカウント」や「配信エラー」の履歴が、新しく登録された別人のデータと紐づいてしまう恐れがあります。その結果、過去の配信レポートが正しく取得できなくなるためです。

CSVにない過去の読者（不要になった読者）を安全に削除し、最新のリスト状態にするには、以下の「ステータス変更（D）」による一括削除手順を行ってください。

削除用CSVファイルの準備：削除したい読者のメールアドレスのみを記載したCSVファイルを用意します。
ステータスの入力：CSVファイルの「ステータス」欄に、半角大文字で「D」（Deleteの略）と入力します。
上書きアップロードの実行：管理画面の「読者一括登録・削除」メニューにて、「上書きする」にチェックを入れた状態で、上記の手順1・2で作成したCSVファイルをアップロードします。
最新リストの追加：不要な読者の削除が完了した後、改めて最新の読者リストを追加登録（または上書き登録）してください。

※補足

CSVファイルの詳しい作成方法や、管理画面での具体的な操作手順につきましては、以下のマニュアルもあわせてご参照ください。